黔产草果不同部位精油化学成分分析及体外抗氧化活性评价

杨海艳1,2,赵天明,张显权2,郭 航2,张 振

(1.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳 550025;2.贵州理工学院食品药品制造工程学院,贵州贵阳 550003)

草果(AmomumtsaokoCrevost et Lemaire),为姜科豆蔻属多年生草本植物。干燥成熟果实属于我国传统的药食同源植物[1];主要种植于热带和亚热带林下的重要经济作物,广泛分布于云南、贵州、广西等3省区,是我国草果的主产区[2]。干草果在食品加工中可作为调味品使用,能够去除牛、羊、鱼肉的膻腥气味;其干燥成熟果实入药具有燥湿温中、健胃清食、除痰截疟等功效[3-4]。草果提取的精油具有减肥降脂降糖[5]、抗肿瘤[6]、抑菌[7,8]、抗氧化[9-10]、促进药物渗透吸收[11]、果蔬保鲜[12]、抗炎和保护神经[13-14]等功效。

草果全株皆含挥发油,主要为萜烯类化合物。相关报道指出不同产地的草果挥发油主成分相似,但含量存在差异[15],马洁等[16]对云南省西双版纳林带内采集的4个地区草果的15种精油成分进行了测定,发现4种不同草果的化学成分含量均存在一定差异;而赵怡等[17]研究发现广西和云南产草果精油主要的成分存在差异,桂、滇两地产的草果挥发油中,倍半萜烯类组、萜醛和萜醇类组分相对含量较高,且产地不同化学成分含量差异较大。黔产草果挥发油成分的相关研究鲜有报道,此外目前草果精油的研究主要是提取工艺和功能性研究,对于草果不同部位的精油成分分布尚不清楚。

因此,本课题组从贵州省草果重要产地毕节市纳雍县采集草果花、茎叶和根,采用水蒸气蒸馏法分别提取草果花、茎叶和根等部位的精油,分析其不同部位精油的化学组分,并比较不同部位的抗氧化活性,以期为黔产草果的合理开发利用提供理论支撑和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草果花、草香茎叶、草香根 采自贵州省毕节市纳雍县余家田坝村;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,纯度97%) 梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;TPTZ(2,4,6-三吡啶基三嗪,纯度≥99%)、Torlox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸,纯度≥97%) 上海麦克林生化科技有限公司;ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐,纯度≥98%) 上海源叶生物科技有限公司;PBS缓冲液 北京索莱宝科技有限公司;甲醇、盐酸、K2S2O8、氯化铁、醋酸钠、醋酸 以上试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

GCMS-TQ8040型气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司;UH5300型可见分光光度 日立制作所株式会社。

1.2 实验方法

1.2.1 植物精油的提取 分别称取100 g自然风干草果花、茎叶和根,剪碎,置于2000 mL圆底烧瓶中加入1600 mL去离子水;放置在升降台上,采用螺旋夹固定冷凝装置后,将圆底烧瓶放置在电热套上进行加热蒸馏,冷凝管回流提取并收集挥发的油性物质,当得到的油性物质无变化后停止加热提取,冷却后打开分液漏斗去除蒸馏水,同时收集提取得到的精油,置于分析天平上准确称取精油质量,然后装入棕色玻璃瓶中,置于-4 ℃冰箱中保存备用。

式中:m表示精油的质量,g;M表示提取物的质量,g。

1.2.2 GC-MS分析条件 色谱条件:SH-Rxi-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm,5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷),升温程序:50 ℃,以10 ℃/min升到110 ℃,再以1 ℃/min升到140 ℃,再以10 ℃/min升到250 ℃,进样口温度250 ℃,分流比:50∶1,进样量:1 μL。

质谱条件:电子轰击(EI);能量:70 eV;进样口温度:230 ℃,接口温度:260 ℃;溶剂延迟:8 min;扫描范围:10～550 u。

RI值的测定:取C8～C40正构烷烃标准品,以正己烷为溶剂配制浓度为0.1%的溶液,采取上述分析条件进行分离,测定各正烷烃的保留时间。各成分的RI值根据Kovats公式进行计算。

式中:RI为被分析组分的保留指数;tx为被分析组分流出峰的保留时间(min);tn为碳原子数为n的正构烷烃流出峰的保留时间(min);tn+1为碳原子数为n+1的正烷烃流出峰的保留时间(min),且tn

定性定量方法:草果挥发油经过GC-MS分析后,通过NIST17-1.lib、NIST17-2.lib、NIST17s.lib、FFNSC1.3.lib质谱库进行自动检索,然后将测定的保留指数值与精油数据库中的保留指数进行比对,物质成分定性指标为质谱库相似度≥90%,化合物保留指数的文献值与实验值相差10以内,色谱峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量。

1.2.3 植物精油抗氧化能力测定

1.2.3.1 DPPH自由基消除能力的测定 DPPH自由基清除活性参照Brand-Williams等[18]的方法稍作修改进行测定。将每种精油20 mg溶解于1.00 mL甲醇溶液中,制得20 mg/mL精油溶液。测定前,用甲醇配制0.024 mg/mL的DPPH溶液。吸取150 μL待测样品,加入6 mL DPPH溶液,置于避光室内静置30 min,甲醇作为空白,于515 nm处分别测定吸光值,精油样品加DPPH溶液测定的吸光值为A0,甲醇样品加DPPH溶液测定的吸光值为A1,每次实验重复3次。植物精油DPPH自由基的清除能力计算公式如下。

通过Trolox(6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic Acid)换算出被测物质抗氧化能力的大小,Trolox是一种维生素E的类似物可以作为对照标准。结果采用Trolox的浓度来表示。

1.2.3.2 ABTS+自由基清除能力的测定 参照Xu等[19]的方法进行测定。将每种精油20 mg溶解于1.00 mL甲醇溶液中,制得20 mg/mL精油溶液。分别吸取精油样品50 μL于试管中,加入4 mL ABTS溶液,混匀,将配制好的溶液于室内避光静置3 min,甲醇作为空白,于515 nm处分别测定吸光值,标准溶液样品加ABTS溶液测定的吸光值为A0,甲醇样品加ABTS溶液测定的吸光值为A1,每次实验重复3次。结果采用Trolox的浓度来表示。

1.2.3.3 FRAP三价铁还原能力的测定 Fe3+还原能力的测定参考Dinis等[20]的方法。分别吸取精油样品150 μL于试管中,首先分别加入450 μL蒸馏水,混匀,接着加入4.5 mL事先预热至37 ℃的FRAP工作液,将配制好的溶液于水浴锅内避光反应15 min,甲醇作为空白,于593 nm下测定吸光值,每次实验重复3次。结果采用Trolox的浓度来表示。

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 2010和SPSS 19.0进行数据统计分析,利用Duncan’s新复极差法比较各处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 草果不同部位精油的提取率

由图1可知,黔产草果不同部位的精油提取率均低于1%,其中草果根的精油提取率最高,达到0.79%;其次为草果花,提取率为0.66%;最低为草果茎叶,提取率只有0.35%。且草果花、根和茎叶之间的提取率差异极显著(P<0.01)。草果根精油提取率相对最高,是草果茎叶精油提取率的2.2倍。

图1 草果不同部位精油提取率Fig.1 Extraction rate of essential oil from different parts of Amomum tsaoko注:小写字母表示同一指标不同部位间差异显著(P<0.05);不同大写字母表示差异极显著(P<0.01);图6同。

2.2 草果不同部位精油GC-MS分析结果

草果不同部位精油的总离子流图如图2～4所示,通过计算机工作站与标准质谱库进行检索,化合物通过保留指数进行定性,峰面积归一化法进行定量,分别确定了草果花、根、茎叶的挥发性化学组成成分,经鉴定,草果不同部位精油共检测到42种组分,所检测到的不同部位精油成分的化学分类见表1。

表1 草果不同部位挥发油中主要特征性挥发化合物的比较分析Table 1 Comparative analysis of the main characteristic volatile compounds in the volatile oil of different parts of Amomum tsaoko

图2 草果花精油成分总离子流图Fig.2 Total ion flow chart(TIC)of essential components from the flowers of Amomu tsaoko

图3 草果根精油成分总离子流图Fig.3 Total ion flow chart(TIC)of essential oil components from the roots of Amomum tsaoko

图4 草果茎叶精油成分总离子流图Fig.4 Total ion flow chart(TIC)of essential oil components from the leaf of Amomum tsaoko

2.2.1 草果花精油成分 从草果花精油共鉴定出26种物质,总相对含量为98.87%。主要为单萜类化合物(68.83%)、含氧单萜类化合物(18.89%)、倍半萜类化合物(1.33%)、含氧倍半萜类化合物(3.64%)、芳香族化合物(5.28%)、其它化合物(0.9%)。其中相对含量超过2%的组分有11种,分别是β-蒎烯(33.42%)、α-蒎烯(11.28%)、桉叶油醇(9.46%)、莰烯(2.82%)、桧烯(4.79%)、水芹烯(6.74%)、P-伞花烃(5.08%)、柠檬烯(4.10%)、异龙脑(3.75%)、4-萜品醇(2.02%)、反式-橙花叔醇(2.04%)。

2.2.2 草果根精油成分 从草果根茎叶共鉴定出25种物质,总相对质量99.75%。主要为单萜类化合物(49.78%)、含氧单萜类化合物(41.39%)、倍半萜类化合物(0.16%)、含氧倍半萜类化合物(5.34%)、芳香族化合物(1.06%)、其它化合物(2.02%)。其中相对含量超过2%的组分油8种,分别是α-蒎烯(8.20%)、β-蒎烯(34.84%)、桉叶油醇(15.97%)、芳樟醇(16.31%)、4-萜品醇(2.16%)、α-松油醇(5.42%)、乙酸松油酯(2.02%)、反式-橙花叔醇(3.45%)。

2.2.3 草果茎叶精油成分 从草果茎叶精油共鉴定出34种物质,总相对质量为97.56%。主要为单萜类化合物(37.59%)、含氧单萜类化合物(12.07%)、倍半萜类化合物(37.51%)、含氧倍半萜类化合物(4.40%)、芳香族化合物(1.74%)、其它化合物(4.25%)。其中相对含量超过2%的组分有10种,分别是α-蒎烯(4.89%)、桧烯(2.89%)、β-蒎烯(21.56%)、水芹烯(2.89%)、柠檬烯(2.86%)、桉叶油醇(8.07%)、左旋乙酸冰片酯(3.58%)、石竹烯(13.77%)、α-律草烯(17.24%)、α-柏木烯(2.10%)。

2.2.4 草果不同部位精油成分的分析比较 草果花、根和茎叶中单萜类化合物和含氧单萜类化合物含量较多。草果花精油中单萜类化合物含量最高,占总含量的68.83%,β-蒎烯、α-蒎烯含量达到33.42%、11.28%。草果根精油中单萜类化合物和含氧单萜类化合物含量差异不大,分别占总含量的49.78%、41.39%,β-蒎烯、芳樟醇和桉叶油醇含量达到34.84%、16.31%和15.97%。草果茎叶精油中单萜类化合物和倍半萜类化合物的含量和种类最多,占总含量的37.59%和37.51%,倍半萜类化合物有11种,石竹烯、α-律草烯含量分别达到13.77%和17.24%。研究表明从云南采集的31批草果茎、叶挥发油进行提取并分析主要化学成分结果可知,草果茎、叶挥发油主要化学成分为桉叶油醇、α-蒎烯、β-蒎烯和D-柠檬烯,四种组分含量可达挥发油总量的80%左右[21]。Cui等[22]从草果精油中共鉴定出34种化合物,其中1,8-桉树脑含量最高,占精油总成分的37.8%。α-水芹烯、P-对丙基苯甲醛和β-蒎烯分别占总成分的5.4%、5.5%和3.8%,与本结果基本一致。

结合图5和表1可以看出,草果不同部位提取的3种精油具有相同的化合物19种,各成分含量在不同部位中的含量存在一定差别,其中,蒎烯类化合物(α-蒎烯和β-蒎烯)是草果花、根、茎叶精油中含量最高的化合物,花(44.70%)>根(43.04%)>茎叶(26.45%)。α-蒎烯和β-蒎烯具有松木香和树脂香,是草果不同部位精油的主要呈香物质[23],α-蒎烯和β-蒎烯具有抑菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎症、抗胃溃疡、抗郁抑症、抗氧化、镇痛等生物及医药活性[24];草果不同部位精油中水芹烯含量花(6.74%)>茎叶(2.89%)>根(0.67),水芹烯具有柑橘香、药草香和青草香[24],且具有抗菌抗炎的生物活性[25];石竹烯的含量茎叶(13.77%)>花(1.15%)>根(0.16%),主要呈现木香、甜香和辛香,具有抗炎、驱蚊虫、抗焦虑、镇咳祛痰等功效[26];桉叶油醇的含量根(15.97%)>花(9.46%)>茎叶(8.07%),具有治疗呼吸道感染、抗氧化、抗炎和镇痛等作用[27]。

图5 草果不同部位精油各类组分的含量差异对比Fig.5 Comparison of different components of essential oil in different parts of Amomum tsaoko

草果花精油中特有的化合物为萜品油烯(1.04%)、反式-松香芹醇(1.00%)和P-伞花烃(5.08%),萜品油烯主要呈现松木香和甜香,具有抗癌、抗氧化、镇痛和抗炎等活性[28];草果根精油中特有的化合物为邻-异丙基苯(0.91%),缬草萜烯醇(0.12%)。此外草果根精油中芳樟醇含量为16.31%,远高于草果茎叶精油中的含量,芳樟醇具有青香、木香和甜香的强烈气味[24],是草果精油中主要呈香物质之一,且具有抗菌、抗炎、抗癌、降血脂和镇痛等作用[29];草果茎叶精油中特有化合物主要为倍半萜类,有9种,其中α-律草烯含量达17.24%,其次是芳香族化合物4-异丙基甲苯(0.19%)和其他类化合物左旋乙酸冰片酯(3.58%)。因此各精油中组分的差异以及各组分相对含量的不同,会导致其生物活性和药理功能存在差异。

2.3 草果不同部位精油抗氧化能力评价

由图6可知,草果根的DPPH自由基清除能力较强,草果花和草果茎叶提取的精油的DPPH自由基清除能力较差,草果根的DPPH自由基清除能力分别比草果花和草果茎叶的清除能力高46.14%和52.25%,说明草果根是三者中DPPH自由基清除能力最强;草果的ABTS+自由基清除能力较强的为草果花和茎叶,两者无显著差异,草果根的ABTS+自由基清除能力最弱。与草果根相比,草果花和草果茎叶分别比草果根高出31.19%和28.97%。草果的FRAP还原能力最强的为茎叶,其次是草果花,最后为草果根,草果花和草果茎叶的FRAP还原能力分别比草果根高出34.88%和62.11%。其中对Fe3+还原能力明显高于对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率,与文献比较差距较大。郭淼等[30]研究发现草果精油清除DPPH自由基、ABTS自由基及络合Fe3+能力较强,研究发现草果精油在浓度2～10 mg/mL的DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率及Fe3+络合率都随着提取物的浓度增加而增大的变化趋势,但2 mg/mL草果精油清除ABTS+自由基效果好于同浓度的BHT。孟大威等[31]对比了两种提取方法得到的草果精油对DPPH自由基的清除率,结果表明当精油浓度在10 mg/mL时,其清除率达到最大,水蒸气蒸馏-乙醚萃取法所得精油清除率为80.00%,采用Cleveger法研究所得的精油清除率为75.80%;韩林等[32]发现草果精油对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力较强的清除能力,对DPPH自由基的EC50为3.84 mg/mL,对ABTS+自由基的EC50为3.20 mg/mL。

图6 草果不同部位精油抗氧化能力评价Fig.6 Evaluation of antioxidant capacity of essential oils in different parts of Amomum tsaoko

3 结论

以水蒸气蒸馏法提取黔产草果不同部位精油,其中草果根的精油提取率最高,其次为草果花,最低为草果茎叶。草果花、根、茎叶精油中分别鉴定出26、25和34种化合物,占各自精油总量的98.87%、99.75%和97.56%。三个部位具有相同化合物19种,分别占各部位精油种类总量的90.7%、67.05%和80.79%。草果花特有3种化合物,占总相对含量7.12%;草果根特有2种,占总相对含量1.03%;草果茎叶特有11种,占总相对含量26.28%,草果不同部位精油中组分的差异以及各组分相对含量的不同,导致其生物活性和药理功能存在差异,因此在以后的研究和研发中,应根据需求选择适合的草果植株部位。

对草果精油不同部位提取的精油进行抗氧化性实验测定,均具有一定的抗氧化活性,其中草果根精油对DPPH自由基的清除能力最高为(11.79±0.73) μmol Trolox/g;草果花精油对ABTS自由基的清除能力最高为(112.96±1.22) μmol Trolox/g;草果茎叶精油对Fe3+的还原能力最高为(77.91±0.38) μmol Trolox/g。说明草果不同部位精油具有较强的抗氧化能力,此实验为草果精油中化学活性物质的开发提供了重要依据。