硒蛋白微胶囊的制备、结构表征及体外消化特性研究

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(1.武汉轻工大学国家富硒农产品加工技术研发专业中心,湖北省绿色富硒农产品精深加工工程技术研究中心,湖北武汉 430023; 2.武汉轻工大学食品科学与工程学院,湖北武汉 430023;3.武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉 430023;4.国家富硒产品质量监督检验中心,湖北恩施 445000)

硒(Se)是人体必需微量元素之一,在体内主要以硒蛋白、硒酶、硒核糖核酸以及硒多糖等多种有机硒形式存在[1-2],且基本存在形式为硒蛋白[3],具有抗氧化、提高机体免疫力[4]、防治克山病和大骨节病的功能。施怡等[5]通过栽培过程中添加不同用量Na2SeO3的方式培养双孢蘑菇,发现蛋白含硒量占比77%～87%,为主要有机硒载体。李春霞等[6]采用硒营养液培育的蓝莓饲养小鼠,与对照组相比血清中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶分别升高了45.93%和55.94%。张浩等[7]通过对糖尿病模型的小鼠灌胃,发现富硒青钱柳多糖较青钱柳多糖具有明显提高糖尿病小鼠免疫力的功效。

利用生物转化因子将无机硒转化成有机硒,可用于开发富硒食品[8-9]。其中,通过添加植物硒蛋白是一种常见的富硒强化食品加工方法。然而,植物硒蛋白作为一种生物活性物质,在强酸碱或过热等环境中易被破坏,另外由于其特殊气味,限制了硒蛋白在食品加工中的应用。微胶囊化是一种常用的嵌入活性物质的技术。该技术不仅可以稳定活性物质,还可以控制活性物质的释放速率,增加活性物质的利用率。相关领域已受到国内外学者的重视。如,张生生等[10]通过锐孔法制备表面活性肽微胶囊,肠液缓释试验中9 h累计释放91.7%,获得了有效的缓释性能。袁靖琳等[11]则以海藻酸钠、壳聚糖为壁材包埋水牛乳活性肽,制备的微胶囊能够较好的保护目标肽、达到了缓释效果。龙门等[12]利用海藻酸钠微囊化JS25噬菌体,固化的JS25噬菌体稳定性显著增加,并且对液态食品具有较高生物防治作用。Khorramvatan等[13]通过调整海藻酸钠浓度、CaCl2浓度以及搅拌速度来优化苏云金芽孢杆菌微胶囊的制备工艺,以此提高其在紫外辐射下的稳定性。本课题组前期通过复合酶处理研制多孔淀粉壁材[14],并用于橄榄油微胶囊化,在改善液体油使用方便性的同时显著改善了其氧化稳定性[15]。微胶囊技术已经得到了广泛的应用,但关于硒蛋白微胶囊的制备及性能研究鲜有报道。鉴于此,本研究拟采用海藻酸钠为壁材,通过锐孔凝固浴法微囊化硒蛋白,通过结构表征以及模拟胃肠液消化试验进一步对其结构特征与体外消化特性进行了探讨,以期提高硒蛋白的稳定性和生物利用度,为富硒食品的开发创立一条新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物硒蛋白 由国家富硒农产品加工技术研发专业中心(武汉轻工大学)提供;海藻酸钠 上海麦克林生化科技有限公司;胃蛋白酶和胰酶 Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司;氯化钙 天津科密欧化学试剂有限公司;盐酸、氢氧化钠 国药集团化学试剂有限公司。

Vario EL Cube元素分析仪 德国元素分析系统有限公司;FD5-2.5冷冻干燥机 西盟国际集团金西盟(北京)有限公司;SB-5200DTN超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;TGL16冷冻离心机 长沙英泰仪器有限公司;S-3000N扫描电子显微镜 日立仪器(上海)有限公司;NEXUS670傅里叶变换红外光谱仪 美国尼高力仪器公司;TGA/DSC/1100SF热失重分析仪 梅特勒-托利多仪器(上海)公司。

1.2 实验方法

1.2.1 硒蛋白微胶囊的制备 分别配制一定浓度的海藻酸钠溶液以及一定浓度(w/v)的CaCl2溶液各10 mL。准确称取0.05 g硒蛋白与海藻酸钠溶液混合,置于一定的超声波清洗机中作用20 min。恒流泵匀速推动装有硒蛋白-海藻酸钠混合物的注射器活塞(0.2 mL/min),维持其在锐孔处均匀滴入凝固浴,期间磁力匀速搅拌(200 r/min),完成固化造粒。利用蒸馏水抽滤洗涤,洗脱表面硒蛋白,将湿态微胶囊于-20 ℃条件下预冻24 h后,置于真空冷冻干机中干燥48 h,得负载硒蛋白微胶囊,备用。

1.2.2 包埋率的测定 采用元素分析法测定硒蛋白含量:准确称量每份样品质量,分别取(5±0.25) mg硒蛋白微胶囊,测定样品中氮元素百分比,包埋率的计算方式具体见如下公式。

式中:N为硒蛋白微胶囊中的氮元素百分比(%);m1为每份样品质量(g);m2为每份样品中添加硒蛋白质量(g),其纯度为40%;6.25为蛋白质换算系数。

1.2.3 硒含量的测定 利用原子荧光光谱法测定硒蛋白中硒含量[16],进而通过包埋率计算硒含量。

式中:N为硒蛋白微胶囊中的氮元素百分比(%);C为硒蛋白中硒含量(μg/g),其纯度为40%;6.25为蛋白质换算系数。

1.2.4 单因素实验 固定海藻酸钠浓度为2.0%(w/v)和包埋操作温度为20 ℃,分别配制浓度(w/v)为1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%的CaCl2溶液,重复1.2.1节中微囊化工艺制备硒蛋白微胶囊,按照1.2.2节计算包埋率,分析CaCl2溶液浓度对硒蛋白包埋率的影响。

固定CaCl2溶液浓度为2%(w/v)和包埋操作温度为20 ℃,分别配制浓度(w/v)为0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%的海藻酸钠溶液,重复1.2.1节中微囊化工艺制备硒蛋白微胶囊,按照1.2.2节计算包埋率,分析海藻酸钠浓度对硒蛋白包埋率的影响。

固定CaCl2溶液浓度为2%(w/v)和海藻酸钠浓度为1.6%(w/v),操作温度分别为10、20、30、40、50 ℃,重复1.2.1节中微囊化工艺制备硒蛋白微胶囊,按照1.2.2节计算包埋率,分析操作温度对硒蛋白包埋率的影响。

1.2.5 响应曲面优化试验 综合单因素实验结果,确定因素水平优化范围,依据Box-Benhnken的中心组合设计原理,以硒蛋白包埋率为响应值,设计三因素三水平响应面优化试验(见表1)。

表1 实验设计因素及水平设计Table 1 Factors and levels of experiment

1.2.6 硒蛋白微胶囊的结构表征

1.2.6.1 硒蛋白微胶囊的微观形貌及粒径分析 用导电胶将适量硒蛋白、硒蛋白微胶囊和空白微胶囊固定到样品台上,经真空镀金后,使用扫描电子显微镜(SEM)对样品微观形貌进行观察,并结合图像分析软件(Image J 1.51)测定统计样品的粒径分布。

1.2.6.2 硒蛋白微胶囊的红外光谱分析 通过KBr压片法,采用傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)分析硒蛋白、硒蛋白微胶囊和空白微胶囊的分子结构和主要官能团。扫描范围4000～400 cm-1,分辨率4 cm-1,扫描16次。

1.2.6.3 硒蛋白微胶囊的热重分析 称取约5 mg硒蛋白、硒蛋白微胶囊和空白微胶囊,采用热重分析仪(TGA),以10 ℃/min的加热速率从30 ℃升温至800 ℃,观察其热失重行为。保护气体为N2(流速为20 mL/min)。

1.2.7 体外释放特性研究 体外模拟消化试验参照已报道的方法[17-18]并作修改:分别取10份硒蛋白微胶囊和空白微胶囊,每份0.1 g,置于西林瓶中,并在瓶中加入10 mL的模拟胃液(pH=2.0),于(37.0±0.5) ℃恒温摇床中震荡,震荡速度为100 r/min,分别在0.5、1.0、2.0 h取出3份用于测定微胶囊在胃液中相对释放率,其余转移至肠液中,分别3、5、7、9、11、13、15 h测定微胶囊在肠液中的相对释放率。在匀浆机10000 r/min破碎搅匀,4000 r/min离心10 min,取上清液用Bradford蛋白浓度试剂盒测定样液中的硒蛋白含量,减去空白干扰,计算相对释放率,以相对释放率对时间绘制出释放曲线。

式中:n为测定样品中的硒蛋白含量(g);m3为每份消化液中添加微胶囊样品质量(g);T为包埋率(%)。

1.3 数据处理

采用SPSS 19.0和Design Expert 8.0进行数据统计分析,显著性水平为P<0.05,作图采用Origin 9.0。

2 结果与分析

2.1 负载硒蛋白微胶囊的制备

海藻酸钠为电解质聚合物,且-COO-带负电荷,采用锐孔凝固浴法将混合均匀的硒蛋白和海藻酸钠滴入CaCl2溶液中,Ca2+将填入古洛糖醛酸和甘露糖醛酸单元之间的空隙中,并与-COO-通过螯合作用相互交联[19],示意图如图1a所示,湿态和冻干后的微胶囊外观图片分别如图1b、图1c所示。

图1 硒蛋白微胶囊的制备Fig.1 Preparation of selenoprotein microcapsules注:a为硒蛋白包埋示意图,b为湿态硒蛋白微胶囊,c为干态硒蛋白微胶囊。

2.2 单因素实验

2.2.1 CaCl2浓度对硒蛋白包埋率的影响 如图2所示,当CaCl2浓度在1.2%～2.0%范围,硒蛋白包埋率随CaCl2浓度的增加而增大,而在2.0%～2.8%范围,随着CaCl2浓度的增加包埋率有所降低。当CaCl2浓度较低时,由于Ca2+直接参与交联,溶液的凝胶化又限制了Ca2+的流动,使得局部地区交联不够,无法形成致密保护层,故而包埋率较低。随着Ca2+的增加,更多的Ca2+填入古洛糖醛酸单元之间的空隙,与其以及甘露糖醛酸中的-COO-通过螯合作用相互交联[19],导致核-壳式结构更加稳定,从而包埋率增加,当Ca2+浓度大于2.0%,包埋率开始下降,可能是因为Ca2+进一步增加,三维结构开始收缩[20],在洗涤干燥过程中微胶囊表面破裂,致使硒蛋白流失。考察CaCl2浓度对硒含量的影响发现其趋势与包埋率变化趋势基本相同,因而,在实验中选择2.0% CaCl2浓度作为最适浓度。

图2 CaCl2浓度对硒蛋白包埋率和硒含量的影响Fig.2 Effects of CaCl2 concentration on selenoprotein encapsulation rate and selenium content

2.2.2 海藻酸钠浓度对硒蛋白包埋率的影响 如图3所示,当海藻酸钠浓度在0.8%～1.6%范围,硒蛋白包埋率呈稳定上升趋势,而浓度由1.6%增至2.4%时,包埋率降低;当海藻酸钠浓度为1.6%时达到最大包埋率82.4%。以上变化是由于在Ca2+浓度不变的前提下,海藻酸钠浓度增加,溶液中线性高分子的海藻酸钠会更多的结合Ca2+交联形成网状骨架(如图1a),使得核-壳式结构加稳定[21-22],凝胶强度增加,进而提高包埋率;但随着海藻酸钠浓度的进一步增加,体系粘度增大,锐孔处造粒压力增大,造粒困难,使得微囊固化后呈不规则形状或有拖尾现象,导致包埋率降低。每份样品添加硒蛋白的质量一定,但海藻酸钠的添加量不同,样品质量会不同,故而在海藻酸钠浓度为0.8%时硒含量会较高,而在浓度为2.0%～2.4%时会降低。综上,选择1.6%作为海藻酸钠的最适浓度。

图3 海藻酸钠浓度对硒蛋白包埋率和硒含量的影响Fig.3 Effects of sodium alginate concentration on selenoprotein embedding rate and selenium content

2.2.3 包埋操作温度对硒蛋白包埋率的影响 如图4 所示,硒蛋白包埋率随着温度的上升呈增加趋势。这是由于升高温度加剧了海藻酸钠分子链段的运动,分子链得以舒展,进而海藻酸钠与Ca2+的交联反应加快。考虑到硒蛋白为活性物质,操作温度上限选择50 ℃。考察硒含量,其趋势变化与包埋率基本相同,故最适包埋操作温度选择50 ℃。

图4 包埋操作温度对硒蛋白包埋率和硒含量的影响Fig.4 Effect of embedding operation temperature on selenoprotein embedding rate and selenium content

2.3 响应面分析

2.3.1 Box-Benhnken试验设计与结果 响应面试验结果见表2,利用Design expert 8.0进行多元回归拟合,得到以包埋率为响应值(Y)对海藻酸钠浓度(A)、包埋操作温度(B)和CaCl2浓度(C)三个因素的二次多项回归方程如公式

表2 Box-Behnken中心组合试验设计与结果Table 2 Box-Behnkencentral composite design matrix and corresponding experimental results

2.3.2 回归方程显著性分析 为了考察模型拟合度,对回归方程进行方差分析,结果如表3所示。该模型P<0.0001,说明该模型极显著,回归方程能够很好的反应出各因素与响应值之间的关系。通过P值检验发现,一次项B、C、交互项AB、二次项A2、C2的P值小于0.01,说明其对硒蛋白包埋率的影响极显著。一次项A、交互项AC的P值小于0.05,表明其对硒蛋白包埋率的影响显著。而交互项BC、二次项B2的P值大于0.05,说明其对硒蛋白包埋率的影响不显著。由F检验可以的出因子贡献率为包埋操作温度(B)>CaCl2浓度(C)>海藻酸钠浓度(A)。经过模型可信度分析失拟项P值0.05003>0.05,对模型式有利,无失拟因素存在,因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。调整决定系数0.9804>0.80,其中变异系数为0.89%,说明该模型只有0.196%的变异,进一步说明模型拟合度较好。

表3 回归方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of the established regression equation

Y=86.63+0.67A+3.34B+1.37C+2.14AB-1.14AC+0.51BC-8.05A2-0.079B2-1.93C2

2.3.3 响应曲面分析 依据各因素对硒蛋白包埋率的影响,选择海藻酸钠浓度、包埋操作温度、CaCl2浓度3个因素。根据回归拟合函数,每2个因素对硒蛋白包埋率画出响应面和等高线图(如图5所示),依次分别为AB、AC、BC交互的响应面图。AB、AC交互项的响应面图曲线较陡,响应面变化较大,表现为对硒蛋白包埋率影响显著,而BC交互的响应面较为平滑，响应值变化较小,说明其对硒蛋白包埋率影响不显著。这与方差分析中的P值检验结果一致。

图5 各因素相互作用对包埋率的影响Fig.5 Effect of factor interaction on embedding rate注:a为包埋温度与海藻酸钠浓度,b为CaCl2浓度与海藻酸钠浓度,c为CaCl2浓度与包埋温度。

2.3.4 响应曲面优化包埋工艺 利用Design expert软件计算出最佳微胶囊制备工艺:CaCl2浓度为2.0%、包埋温度为49 ℃、海藻酸钠浓度为1.6%,此时包埋率达到89.7%,根据回归方程的得出的最优工艺条件进行实际的验证,进行3次重复性验证,得到微胶囊包埋率为87.4%,与回归方程得出的理论值相比下降了2.3%。验证值与预测值的相对误差为2.46%,误差较小,表明试验建立的模型优化结果具有可靠性。

2.4 微胶囊结构表征

2.4.1 微观形貌分析及粒径分析 为了观察硒蛋白微胶囊的包埋形态,通过扫描电子显微镜对硒蛋白(图6a)、空白微胶囊(图6b)以及硒蛋白微胶囊(图6c)的微观形貌进行分析。由电镜图可以看出硒蛋白呈均匀球形,空白微胶囊表面致密,而对硒蛋白进行包埋之后,表面有圆球状物质被紧密包裹,证实硒蛋白成功被包埋。由图6d、图6e可以看出,负载硒蛋白微胶囊的粒径主要集中在750～900 μm范围内,占比达到了86%,平均粒径为(848.1±60.2) μm。

图6 扫描电子显微镜图及粒径分布图Fig.6 Scanning electron micrograph and the particle size distribution map注:a为硒蛋白(2000×),b为空白微胶囊(100×),c为硒蛋白微胶囊(500×),d为硒蛋白微胶囊(30×),e为粒径分布图。

2.4.2 红外光谱分析 在观察到硒蛋白被包埋入微胶囊的基础上,进一步借助FTIR分析分子结构的差异。图7分别为硒蛋白、空白微胶囊和负载硒蛋白微胶囊的红外谱图。硒蛋白的红外吸收谱线如谱线a所示,883 cm-1附近出现特征峰,可能是Se与蛋白形成共价键引起的;1051和1089 cm-1附近出现两个吸收峰,是由于C-O键的振动;1240 cm-1为酰胺III带的特征吸收峰,来至于C-N的伸缩振动[23];2977 cm-1附近的吸收峰对应C-H的伸缩振动[24];3270～3420 cm-1的宽峰是由-NH2的伸缩振动引起的。谱线b为空白微胶囊红外谱线,分别在1427和1614 cm-1附近出现吸收峰,归因于海藻酸钠-COO-的反对称伸缩振动和对称伸缩振动;3434 cm-1出现宽而强的吸收峰是由于海藻酸钠分子间形成氢键[25]。谱线c中海藻酸钠对硒蛋白进行包埋后得到的硒蛋白微胶囊,在883、1280、1430、1616 cm-1分别出现了硒蛋白和海藻酸钠的特征峰,而在3400 cm-1近峰值的增大,是因为-NH2的存在和分子内氢键共同作用的结果。以上结果进一步证实了海藻酸钠形成的微胶囊结构成功负载了硒蛋白,这与SEM结论一致。

图7 硒蛋白微胶囊红外光谱图Fig.7 FTIR spectra of selenoprotein microcapsule注:a为硒蛋白,b为空白微胶囊,c为硒蛋白微胶囊。

2.4.3 热重分析 利用TGA考察硒蛋白和微胶囊的热分解行为。如图8所示,从30 ℃升温至100 ℃,硒蛋白质量下降了8.2%,这归因于样品中自由水分的减少。由于冻干后的微胶囊具有一定的吸湿性,其内部吸附水分较多,因此空白微胶囊和硒蛋白微胶囊质量损失分别下降13.4%、10.9%。随着温度的继续升高,在100～132 ℃,硒蛋白的热分解速率趋于平缓,出现一个平台,但随着温度的进一步提高,硒蛋白开始受热分解,质量急剧下降。而空白微胶囊和硒蛋白微胶囊分别在217.1和211.8 ℃开始进入剧烈热分解阶段,在517 ℃附近再次进入平台区,质量分别下降了35.6%、40.7%,而硒蛋白此时质量下降60.3%,表明硒蛋白热稳定较差,而包入海藻酸钠微胶囊的壳层后对其起着保护作用,提高了热稳定性。

图8 硒蛋白微胶囊热重分析曲线图Fig.8 TGA curves of selenoprotein microcapsule

2.5 体外释放特性研究

减少硒蛋白被胃液的破坏,控制其缓慢持续释放对其生理活性的发挥具有重要意义。本研究在前2 h考察了负载硒蛋白微胶囊在模拟胃液中的释放行为,后转到模拟肠液中,进行另外1～13 h测试(对应图9中3～15 h)。如图9所示,负载硒蛋白微胶囊在模拟胃液中消化2 h,硒蛋白累计释放8.9%,进入模拟肠液后,硒蛋白迅速释放,经13 h模拟肠液消化后,释放已经接近饱和,此时的释放量高达88.2%,说明了海藻酸钠与Ca2+形成的微囊能够在模拟胃酸的条件下能够稳定存在且不被破坏,具有较好的抵抗模拟胃液(pH=2.0)消化的能力,而在相对温和的模拟肠液(pH=6.8)中发生溶胀并缓慢释放,即采用海藻酸钠为壁材制备的负载硒蛋白微胶囊具有肠溶性。以上研究有望实现硒蛋白的缓释、靶向输送以及提供高生物利用度,有望应用于富硒功能食品的开发。

图9 硒蛋白微胶囊体外模拟消化累计释放曲线Fig.9 Continuous release curve of selenoprotein microcapsules in the in vitro digestion system

3 结论

本研究以海藻酸钠为壁材,采用锐孔凝固浴法制备负载硒蛋白微胶囊,在单因素试验的基础上结合响应面分析法得到硒蛋白微胶囊最佳工艺条件:海藻酸钠浓度1.6%(w/v)、CaCl2浓度为2%(w/v)和包埋操作温度49 ℃。在此条件下硒蛋白包埋率为87.4%,平均粒径为(848.1±60.2) μm。经过海藻酸微胶囊包埋后,硒蛋白的特殊气味得到了有效掩盖。通过SEM结果可以直观观察到硒蛋白被完整有效的包裹在海藻酸钠微胶囊中,而FTIR和TGA分别从分子结构和热失重曲线变化上验证了这一结果。此外,TGA分析还证实了硒蛋白经海藻酸微胶囊包埋后,其热稳定性得到了明显的提高。此外,微囊化的硒蛋白有效减少其在胃液中的破坏,提高其在肠液中的缓释能力,表现为在模拟胃液中消化2 h仅释放8.9%,在模拟肠液中消化13 h后累计释放88.2%。

以上研究结论为硒蛋白的高值化利用及在富硒食品加工中的稳定性与生物利用提供了理论基础。在后续工作中,将进一步研究硒蛋白在肠道的分布渗透和保留吸收以及功能性评价,推进其作为有效硒助剂应用于富有机硒食品的开发。