林木组培工厂化育苗中增殖培养优化技术探讨

滕秀兰，史绍林(.黑龙江省桦川县林业局，黑龙江 佳木斯 54300；.黑龙江省森林与环境科学研究院，黑龙江 齐齐哈尔 6005)

自从组织培养技术应用到林木繁殖领域以来,已有部分树种通过组培工厂化技术实现了大规模繁殖。但是大部分树种仍然停留在实验室阶段，没能实现产业化，其中最主要的原因在于增殖阶段繁殖系数低，不能实现几何式成倍的增长。林木组培工厂化生产是个系统工程，若要实现真正的工厂化生产，增殖阶段的优化技术是重中之重。结合多个木本植物工厂化生产的经验，探讨增殖培养中的优化技术。

1 基本培养基优化

基本培养基提供植物组织生长的矿物质、碳水化合物。林木组培增殖培养中，基本培养基优化是最经常优化的内容。MS培养基是在被子植物门林木组织培养中最为常用的培养基。其具有较高的无机盐浓度，常常在大多数树种中应用。但是因为树种不同MS培养基有很多地方需要调整，笔者在快速繁殖美国红枫“秋焰”(Acer×freemanii)、“萨摩赛特”(Acerrubrum‘Somerset’)中增加硝酸铵、硫酸盐含量改良MS培养基，发现改良MS对不定芽的增殖作用最明显，增殖倍数显著高于培养基MS、WPM和1/2MS等。然而在桦树类增殖培养中，无机盐含量较低的WPS或者1/3MS等培养基更有利于不定芽的增殖，如果增加无机盐的含量很容易导致紫叶白桦(Betulapopulifolia‘Whitespire’× B.‘Crimson Frost’)、垂枝桦(BetulapendulaRoth)等树种的玻璃化。我们在山新杨(Populusdavidiana×bolleana)组培工厂中利用1/2MS作为基本培养基，用微茎段扦插的方法提高增殖倍数3～4倍。培养基中Ca2 +浓度对于其试管苗的增殖生长也起到重要作用，其浓度增加可有效抑制玻璃化及茎尖坏死，因此也常常需要通过增添来优化。另外增殖培养的基本培养基优化时pH值的影响也应该是优化的范围，而且往往容易忽略，大多数树种培养基中pH值的范围在5.8～6.2之间均可，但很多树种需要优化，例如曹增强等[1]通过试验发现适当的提高培养基pH值(6.0～6.5)会促进蓝莓分支组培苗的分支，这样可以大幅提高增殖倍数。培养基pH为7.0时，则会促进蓝莓组培苗对Fe、Ca和B的吸收，因此需要在增殖培养时不断调整，笔者发现在美国红枫增殖培养时pH值在5.6时不定芽增殖最佳,增殖倍数平均可达3.19倍。

2 不同植物激素种类及配比优化

植物激素是在调控植物生长发育过程中具有十分重要且复杂的生理效应[2]。在林木快繁增殖培养中主要应用细胞分裂素和生长素调节优化不定芽的增殖培养，细胞分裂素过去常常用6-BA，KT、 ZT等。近年来TDZ和CPPU常常用在增殖培养中，CPPU是一种具有显著生物活性的细胞分裂素，活性远高于一般的嘌呤类细胞分裂素[3]，它还有独特的优势在于促进细胞分裂后持续的促进生长能力。TDZ作为一种有效的形态发生调节剂，其特点是通过单独或与其他生长调节物质共同对植物细胞起作用，并具有相当高的活性[4]。植物组培中常用的生长素有IBA、.2,4-D和NAA等，增殖培养的优化过程中不但需要添加细胞分裂素和生长素绝对含量，而且要优化相对含量，由于植物激素添加含量极微，试验设计添加常常是失之毫厘谬以千里。随着生物统计学的发展与应用，近年来利用二次回归旋转设计等能够较好的筛选植物激素的绝对含量和相对含量[5-6]。同时应该考虑连续多次增殖培养高浓度细胞分裂素的添加会导致组培苗玻璃化的危害。

3 最佳增殖时间和培养代数优化技术

在增殖过程中，不定芽的生长是个曲线生长过程，生长速度从启动生长—快速生长—缓慢生长的过程，为了实现增殖培养高效的繁殖速度，需要培养过程中细致观察，在最恰当的时间进行继代培养。同时不定芽的来源往往是腋芽或间接的愈伤组织等，继代培养代数太短往往繁殖效率低，继代培养代数过长往往伴随玻璃化危害、退化等情况的发生。

4 其他优化技术

其他优化技术主要包括：(1)优化接种数量，控制接种不定芽的密度。 在增殖优化过程中很多实践者发现不定芽的密度也是需要优化的技术，这点往往被理论学者忽视，笔者发现为了充分利用培养基、光照和培养空间，在培养容器内“品”字形接种不定芽，根据每次接种树种的不同和不定芽的大小调整接种数量。(2)优化培养基的注入量。由于不同的树种在增殖阶段生长速度有差异，增殖时间内消耗培养基的含量自然就会有差异，因此为了降低成本需要通过细致入微的观察调整优化培养基的注入量，有时候也可以考虑重复使用培养基，笔者在山新杨增殖培养中曾试验控制培养基的含量，取得了较好的效果。

参考文献：

[1] 曹增强,徐莹莹,张宁.不同pH值对蓝莓组培苗生长和元素吸收的影响[J].中国农业大学学报,2006,21(2):50-57

[2] Santner A,Calderon-Villalobos L I A,Estelle M . Plant horm ones are versatile chemical regulators of plant growth[J]. Nat Chem Biol,2009(5): 301-307

[3] 高金山,边庆华．细胞分裂素CPPU的研究进展[J]．农药,2006,45(3):151-153

[4] 徐晓峰,黄学林．TDZ:一种有效的植物生长调节剂[J]．植物学通报,2003,20(2):227-237

[5] 徐位力,罗焕亮,范恩友,等. 二次正交旋转组合设计对马占相思组培增殖培养基的优化[J]. 广西植物,2002,22(6):517 -520

[6] 万颖丽,王长伟,刘君.二次正交旋转组合设计在文心兰组培快繁技术中的应用[J]．2009(8):122-127