全反式维甲酸联合5-氟尿嘧啶对ECA109细胞增殖、迁移和VEGF表达的影响*

李珊珊，罗忠民，崔会娟，王珍珍，彭 湃，李 娜，路太英#

1)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州450052 2)焦作市第二人民医院肿瘤科 焦作454002

食管癌是发病率高、预后较差的实体瘤之一。食管癌患者在诊断时多数已属于晚期，失去手术治疗的机会［1］，目前主要采用化疗联合放疗等综合治疗方式，而化疗往往引起诸多毒副反应导致治疗效果欠佳。近年研究［2］表明，诱导分化治疗已成为一种重要的肿瘤治疗方法，其中全反式维甲酸(AT-RA)是目前诱导分化剂中最重要并已用于临床的药物。5-氟尿嘧啶(5-FU)是消化系统常用化疗药物，但是逐渐出现的耐药却限制了其临床应用，因此临床上主张联合用药。有研究［3］显示，ATRA 和5-FU联合应用对食管癌细胞有协同抑制生长和诱导凋亡作用，但具体机制尚不完全清楚。该研究通过体外实验观察ATRA 联合5-FU 对食管肿瘤血管生成的影响，探讨两者抑制肿瘤细胞生长的可能机制，为提高食管癌的疗效提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 主要药物和试剂 DMEM 培养基、DMSO 均购自北京索莱宝科技有限公司，胎牛血清为杭州四季青公司产品，ATRA(用无水乙醇配制成1 000 μmol/L 的储备液，4℃避光保存)、MTT 均购自Sigma 公司，5-FU 购自上海旭东海普药业有限公司，兔抗人血管内皮生长因子(VEGF)抗体、即用型SABC 免疫组化染色试剂盒及DAB 显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，Trizol 由美国Invitrogen 公司生产，逆转录试剂盒购自日本TaKaRa 公司，PCR试剂购自北京康为世纪生物技术有限公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1．2 细胞培养和实验分组 Eca109 细胞由中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室赠送。Eca109 细胞单层贴壁生长于含体积分数10%胎牛血清的DMEM 培养液中，37℃、体积分数5%CO2培养箱中常规培养，隔日换液，取对数生长期细胞进行实验。常规传代的Eca109 细胞分为4组:ATRA组(ATRA 终浓度为5 μmol/L)、5-FU组(5-FU 终浓度为50 mg/L)、ATRA +5-FU组(ATRA 终浓度为5 μmol/L，5-FU 终浓度为50 mg/L)和对照组(仅含Eca109 细胞)。

1．3 MTT 法检测各组细胞生长抑制率 取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化后调整细胞密度为3 ×104mL－1，接种于96 孔培养板内，每孔200 μL，贴壁后按1．2 分组并进行处理。每组设5个平行孔。分别培养24、48、72 h 后，每孔加入MTT 液(5 g/L)20 μL。继续孵育4 h 后弃去孔内上清液，每孔加100 μL DMSO，振荡摇匀。选择490 nm 波长，酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(A)值，计算细胞生长抑制率，细胞生长抑制率=(1 －实验组A 值/对照组A值)×100%。

1．4 划痕实验检测各组细胞的迁移能力 取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化后以5 ×105个/孔接种于6 孔板中，作用24 h 后，用无菌枪头沿细胞中部划一条直线，按1．2 进行分组和处理。每组设3个平行孔。分别在0、24 h 拍照，用图像处理软件测量划痕宽度，计算迁移率，迁移率=(1 －实验组划痕宽度/对照划痕宽度)×100%。

1．5 RT-PCR 法检测各组细胞VEGF mRNA 表达情况 收集经不同处理组作用48 h 后的细胞，提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录获得cDNA。VEGF(产物大小350 bp)上游引物:5'-AGGGCAGAATCATCACGAAG-3';下游引物:5'-CCTTTCCCTTTCCTCGAACT-3';内参GAPDH(产物大小504 bp)上游引物:5'-TGATTCCACCCATG GCAAATTCC-3';下游引物:5'-ACAGCCTTGG CAGCGCCAGTAGA-3'。将引物与逆转录产物在50 μL 体系中进行扩增。反应条件:94℃预变性4 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环30次;最后72℃延伸10 min。循环完成后取10 μL PCR 产物在10 g/L 琼脂糖凝胶中电泳后，采用凝胶成像仪进行扫描拍照，用Gel Analyzer 软件进行灰度值分析，以VEGF 条带灰度值与GAPDH条带灰度值之比作为VEGF mRNA 的相对表达量。实验重复3次。

1．6 免疫细胞化学法(SABC 法)检测各组细胞VEGF 蛋白表达情况 按1．2 分组制作细胞爬片，加药后培养48 h 取出，40 g/L 多聚甲醛固定30 min，体积分数0．2% Trixton-100 处理15 min，体积分数3% H2O2室温处理10 min，用试剂盒中的血清封闭液在37℃封闭20 min，加入一抗(1∶300 稀释，兔抗人)4℃过夜，将PBS 代替一抗作为阴性对照;二抗孵育20 min，SABC 37℃孵育20 min，PBS反复漂洗，DAB 显色10 min，自来水冲洗，苏木素复染15 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。镜下观察，每组细胞选取3 张爬片，采用病理图像分析软件进行半定量分析，以灰度值作为VEGF 蛋白的相对表达量。

1．7 统计学处理 采用SPSS 17．0 进行数据分析。不同组间细胞生长抑制率的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验;不同组间迁移率、VEGF mRNA 及蛋白相对表达量的比较采用2 ×2析因设计的方差分析。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 各组细胞生长抑制率的比较 结果见表1。

2．2 各组细胞迁移率的比较0h时各组细胞迁移率均为0．00%。见表2、图1。

表1 各组细胞生长抑制率的比较(n=5) %

表2 各组细胞迁移率的比较(n=3) %

图1 不同处理对Eca109 细胞迁移能力的影响(×200)

2．3 各组细胞VEGF mRNA 和蛋白表达情况VEGF 蛋白阳性表达:呈棕黄或棕褐色颗粒状，主要分布于细胞质，核膜亦可见表达。见图2、表3 和图3。

图2 各组细胞VEGF mRNA 表达情况

表3 各组细胞VEGF mRNA 和蛋白表达情况(n=3)

图3 各组细胞VEGF 蛋白表达情况(SABC，×400)

3 讨论

5-FU 是临床常用抗肿瘤药物，但其毒副作用限制了其在临床上的应用［4］。诱导分化治疗最初是由Pierce 等［5］提出。分化诱导剂调节肿瘤细胞分化，使肿瘤细胞转化为正常细胞或导致细胞凋亡，可以改善肿瘤患者的预后，为肿瘤的化学药物治疗提供一个新领域。ATRA 作为重要的诱导分化剂之一，临床研究比较广泛。近年来，诸多学者［6-10］发现其在抑制实体肿瘤细胞增殖、促进细胞分化和凋亡方面有重要作用，但具体机制尚不明确。VEGF 在多种实体瘤组织中均有表达，在食管癌组织中的表达率可达65%，细胞株中可达100%［11］。实验［12-14］表明ATRA 具有抑制多种肿瘤细胞分泌VEGF 的作用。Zage 等［15］研究表明，ATRA 可抑制神经母细胞的VEGF-R，降低血管通透性，抑制内皮细胞分裂、增殖和迁移，从而抑制肿瘤细胞增殖。有研究［16］发现，5-FU 对HepG2 肝癌细胞中VEGF 的表达具有抑制作用。

该研究结果显示，ATRA 和5-FU 联合作用于Eca109 细胞后，细胞生长抑制率明显高于各单药作用组及对照组;RT-PCR 及免疫细胞化学法检测结果也提示，ATRA、5-FU 单药作用均能下调VEGF mRNA 和蛋白的表达，且两者联合应用下调作用更为明显。由此提示，ATRA、5-FU 均可抑制Eca109细胞的生长，并且可能与其下调VEGF mRNA 和蛋白表达有关。基于实验结果可以看出，两者联合应用可以通过下调VEGF 的表达抑制肿瘤血管生成从而抑制细胞生长，增强化疗疗效。因此，化疗联合诱导分化剂ATRA 为食管癌的防治带来一定的希望，为ATRA 在临床上的应用提供一定的实验依据。

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