60Coγ射线辐照剂量对明胶特性和结构的影响

耿胜荣，汪 兰，廖 涛，夏和舟，＊

（1.湖北省农业科学院 农产品加工与核农技术研究所，湖北 武汉 430064；2.湖北省农产品辐照加工中心，湖北 武汉 430064；3.湖北省农业科技创新中心，湖北 武汉 430064）

明胶是一种水解胶原蛋白，具有可溶、增稠、热可逆、成膜、乳化等理化性质，在照相、工业、食品和医药方面有广泛的应用，其中制药工业和生物医 学 领 域[1－2]已 成 为 当 今 应 用 和 研 究 的 热点[3－6]。明胶的主要成分是蛋白质，其是细菌生长的优质培养基，极易遭到病原菌污染而丧失应用价值。在防止外来病原物侵染的同时，对明胶材料进行灭菌更是必不可少的。在众多的灭菌法中，辐照具有非接触性、冷杀菌、穿透性强、操作方便等优点，尤其适合稳定性差的蛋白类材料。

辐照法应用于明胶灭菌早在20年前就有相关报道，早期建立的明胶辐射灭菌工艺仍沿用至今。随着辐射技术在各行业的推广应用，小规模辐射源现大部分已退役，源座和源强大幅增加，排列设计也有变化。辐射条件的变化必然带来新的辐射效应，另外，当代明胶被赋予更多的应用功能，人们对它的要求不仅停留在卫生学水平上，因此，新的辐射灭菌工艺建立迫在眉睫。本文从辐射剂量入手，研究辐照前后明胶流变性、凝胶性、力学性能、热学性能和结构的变化，探索剂量与性能和微观结构的关系，为确定最佳辐射剂量提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

明胶，国药集团，化学纯；60Coγ辐照源，设计装源容量1.85×1016Bq，现有放射性活度5.84×1015Bq，湖北省辐照实验中心；凝胶渗透色谱，高效液相色谱泵（waters1515，美国）、waters2690D分离模块、waters2410折射率检测器、二支色谱柱（waters ultrahy drogel 2000，250）串联使用；扫描电镜，Quanta 200，荷兰FEI公司；试验机，深圳市瑞格尔仪器有限公司；示差扫描量热仪，DSC200F3，德 国 Netzsch 公 司；质 构 仪，TAXTPlus，英国SMS公司；电泳仪，DYY-12，北京六一仪器厂；50mL稀释型乌氏黏度计等。

1.2 辐照处理

明胶（含水量约为7.5%）用自封口袋包装，每份50g。采用动态悬挂辐照的方式分别照射4～52kGy，每个剂量样品附有两支硫酸亚铁剂量计跟踪剂量，实测剂量计的平均值作为样品的吸收剂量。以未辐照样品作为对照。照射完后立即取样测定各指标。

1.3 测定方法

1.3.1 特性黏度 取0.5g明胶，加入14.5g蒸馏水，室温溶胀，55℃水浴溶解，配制成初始浓度C0为3.33%的明胶水溶液。此后用蒸馏水逐次稀释成原浓度的2／3、1／2、1／3和1／4。用0.45mm乌氏黏度计在37℃下测定不同浓度C的样品流出两刻度线的时间t和蒸馏水流出时间t0。依次计算相对黏度ηr＝t／t0、增比黏度ηsp＝ηr－1。以C为横坐标，ηsp／C和lnηr／C为纵坐标作图，两条折线与y轴的截距H1和H2的平均值为H。H／C0即为特性黏度[η]。

1.3.2 断裂伸长率及断裂强度 取5g明胶，加44g蒸馏水，55℃水浴溶解，加入1g甘油，混匀，超声脱气30s后，倒入预先涂抹硬脂酸钠的托盘中，将托盘放入鼓风干燥箱中50℃干燥约4h后揭膜。将膜放在内置Mg（NO3）2·6H2O过饱和溶液的干燥器（相对湿度52%）中平衡水分48h。平衡好的膜在拉力机配套的裁具上裁成条，测量厚度，上拉伸机。拉伸模式试验标准GB 1040—92，定伸长率20%，标距25mm，试验速度100mm／min，定应力0.1mPa，试验面积1.56mm2。

1.3.3 凝胶强度 在文献[7]的基础上进行改进，质构仪测定参数按美国试验标准GMIA进行。

1.3.4 熔化温度及胶凝温度 在文献[8-9]的基础上进行改进。取样品5mg，双蒸水10mg，用进口铝坩埚（耐驰仪器公司产）封装，在20℃以下环境中平衡过夜。示差扫描量热仪（DSC200F3）的温度程序为：10～55℃，升温速度5℃／min；55℃恒温2min；55～10℃，降温速度5℃／min，5℃恒温2min，65℃结束。分别在升温、降温曲线中寻找吸、放热峰，并分析峰温、起始和结束温度，即为熔化温度和胶凝温度。

1.3.5 相对分子质量 采用高效液相色谱泵（waters1515）测定。方法在文献[10]的基础上进行 改 进。配 制 1 000mL 的 0.1mol／L Na2HPO4，其中含8g NaN3，用 NaH2PO4调节pH值至8.0，取500mL作为储备液。另取500mL储备液稀释至2 000mL作为淋洗液；进 样 量 为 100μL，溶 剂 为 H2O-0.2mol／L NaNO3，淋洗液流速为0.6mL／min。标样为聚乙烯乙二醇，柱子温度40℃，检测器温度40℃。

1.3.6 蛋白组分分布 SDS-PAGE电泳采用12%分离胶和4%浓缩胶，样品浓度为2mg／mL，上样量为20μL。浓缩胶电压为60V，分离胶电压为100V，电泳时间为2h左右。25%戊二醛水溶液固定电泳后的胶块0.5h，考马斯亮蓝R250染色过夜，用脱色液脱色3次。脱色后的胶块照相保存。

1.3.7 表面形貌分析 采用扫描电镜进行分析。配制未照射和照射57.9kGy的明胶10%的水溶液各100mL，低温下形成凝胶后，在－80℃冰箱速冻，再冻干，取少量冻干样品做表面和截面扫描。

2 结果与讨论

2.1 辐照剂量与明胶水溶液黏度的关系

不同辐照剂量对明胶溶液特性黏度和相对黏度的影响示于图1。由图1可看出，未辐照的明胶水溶液特性黏度和相对黏度分别为46.63mL／g和4.41。辐照后明胶水溶液两种黏度随剂量的增大均呈下降趋势，低于17.2kGy辐照处理的样品下降速度较快，高于17.2kGy辐照处理的样品下降速度趋于平缓。生产常用8kGy辐照处理时，样品的特性黏度和相对黏度分别为对照的88.5%和82.8%。特殊要求经25kGy照射后，特性黏度和相对黏度分别为对照的65.3%和70.7%。这说明辐照降低了明胶的黏度。

图1 不同辐照剂量对明胶溶液特性黏度和相对黏度的影响Fig.1 Effect of irradiation on intrinsic viscosity and relative viscosity of gelatin solution

2.2 辐照剂量与明胶膜力学性能的关系

不同辐照剂量对明胶膜力学性能的影响示于图2。从图2可看出，未辐照明胶膜的断裂强度和断裂伸长率分别为2.09MPa和228.97%，辐照后的明胶膜的断裂强度升高，范围在2.61～3.66MPa，而断裂伸长率随剂量的增加呈明显的下降趋势，范围在90.19%～186.83%。这说明，辐照加大了膜的刚性，减小了膜的韧性。

图2 不同辐照剂量对明胶膜力学性能的影响Fig.2 Effect of irradiation on tensile strength and elongation of gelatin film

2.3 辐照剂量与明胶胶凝特性的关系

2.3.1 凝胶强度的变化 凝胶强度反映凝胶体系的刚性程度，是药用明胶国标中的重要标准。明胶凝胶强度越大，说明分子相互缠结形成的凝胶网络结构越致密，网络结点数越多[8]。图3a为凝胶强度与剂量的关系。图3b为凝胶强度测定图谱，由测定时间与探头感应的力绘制的曲线为单峰型，取峰值为该样品的凝胶强度。未辐照的明胶6.67%水溶液凝胶过夜，其凝胶强度为597.8g，辐照后明胶的凝胶强度随剂量的增加呈下降趋势。

图3 不同辐照剂量对明胶凝胶强度的影响Fig.3 Effect of irradiation on strength of gelatin gel

图4 明胶辐照后胶凝温度和熔化温度（a）以及DSC扫描图（b）Fig.4 Gel point and melting point of irradiating gelatin（a）and DSC spectrum （b）

2.3.2 胶凝温度和熔化温度 熔胶－凝胶转变临界温度点称为胶凝温度和熔化温度。明胶辐照后胶凝温度、熔化温度和DSC扫描图示于图4。图4b中升、降温阶段约5min和15min时分别出现了吸、放热峰。从图4a可见，对照的熔化温度和胶凝温度分别为26.1℃和43.9℃。除52.8kGy外，辐照后明胶样品的熔化温度均较对照的高，范围为27.0～28.9℃。辐照后明胶样品的凝胶温度均较对照的低，范围为40.8～42.4℃。辐照引起明胶的熔化温度升高，说明分子吸热解链热能增加，明胶网络结构对热稳定，分子发生了交联。辐照引起凝胶温度降低，说明分子自发形成网络结构困难，分子发生了降解。熔化温度低于凝胶温度，且熔化时峰值处27.8℃热流速度（0.444 7mW／mg）大于凝胶时峰值41.2℃处热流速度（－0.395 4mW／

mg），这说明，明胶胶凝状态与溶液态互转时吸收和放出的热能是不等量的。在本实验中，明胶分子发生分解反应的同时还伴随少量的交联，故有熔化温度升高的现象。

2.4 辐照对明胶分子质量及蛋白组分的影响

不同剂量辐照后明胶的凝胶渗透色谱图和SDS-PAGE电泳图示于图5。从图5a可见，未辐照明胶的GPC峰高而尖锐，辐照处理的明胶GPC出峰晚，且峰形变得矮而宽，剂量越大峰形越宽。结合GPC实验给出的数值来看，未辐照明胶相对分子质量分布为3.60，辐照后的相对分子质量分布大于未辐照样品，其范围为3.85～4.76。未辐照明胶的相对数均分子质量Mn、相对重均分子质量Mw和相对峰位分子质量Mp分别为48 863、175 864和59 759，辐照后明胶的3种相对分子质量均随剂量的增大而下降。这说明，辐照将大分子降解，形成更多种小分子的混合物。

图5b中，未辐照明胶样品可见β、α1和α2共3个条带。在α1以上和以下部分，随着剂量的加大，条带逐渐加宽、变模糊、颜色下移。这说明β、α1和α2逐渐降解，降解成小分子肽段混合物，剂量越大，β、α1和α2含量越少，而肽段混合物越多。明胶的4种组分中，α1含量最高，也是最耐降解的，辐照46.6kGy后仍存在。其次是α2，辐照26.8kGy仍存在。γ、β含量较少，辐照降解也最快。

2.5 辐照对明胶结构的影响

未辐照和57.9kGy辐照明胶表面及截面的SEM图示于图6。图6a和图6c分别为未辐照和辐照57.9kGy明胶的放大500倍表面图，前者表面看到有颗粒，而后者表面光滑，成膜性好。这是因为经辐照57.9kGy后，溶胀性差的大分子大部分降解为溶胀性较好的小分子，溶胀后分子排列更整齐，表面更光滑。图6b、d分别为未辐照和辐照57.9kGy明胶的截面图，后者的网状结构较前者更为致密有序。这些说明，辐照促使了蛋白分子的分解和小量交联，明胶表面更为致密，截面从疏散网状转变为致密网状。

图5 不同剂量辐照后明胶的凝胶渗透色谱图和SDS-PAGE电泳图Fig.5 Gel permeation chromatogram and SDS-PAGE analysis of irradiated gelatin

图6 未辐照和57.9kGy辐照明胶表面及截面的SEM图Fig.6 Scanning electron microscope photographs of surface and section of gelatin

3 讨论

明胶是由少量三股螺旋链γ、两股螺旋链β和单链α以及大量多聚肽组成的混合物[10]。明胶分子中的氨基酸侧链基团在发生氧化或自氧化反应时形成醛基，促发多肽链之间以及胶原分子之间的交联反应[11]。交联反应与链的断裂之间存在着竞争[12]。有报道认为，明胶的辐射效应主要是裂解占优势[13]。本研究结果与报道存在异同点。本文认为，明胶在有氧和有限水的条件下，辐照以降解为主，交联为辅。明胶在0～57.9kGy范围内有氧辐照后，黏度、凝胶强度、胶凝温度、Mn、Mw和Mp，α、β、γ组分含量随剂量的增加而下降，而多肽混合物含量、相对分子质量分布宽度随剂量的增加而增加。根据高斯方程，黏度越小对应黏均分子质量越小，辐射后黏度的下降说明黏均分子质量的下降。凝胶强度与明胶的α组分是呈正比的[7]，其下降说明α组分含量的下降。凝胶渗透色谱结果和SDSPAGE分析更直接说明了这一点：辐照剂量越大，分子质量和蛋白组分的降解越明显，辐射降解后的明胶膜更平，结构更为致密。

但另一方面，超过17.2kGy剂量辐照的明胶水溶液中有明显不溶物。这说明辐照引起明胶分子分解的同时，也发生少量交联反应。且黏度下降的原因有两方面，一方面分解，另一方面重度交联减少了明胶水溶液的浓度。明胶辐照后，其凝胶的熔化大于对照也与交联有关：辐照后的明胶，其水溶解物中存在两种体系，一是完全溶解部分，它来源于明胶大分子的降解，一是交联产物，是不溶部分。这两种体系对应2个凝胶熔化峰温，分解物在20℃左右，交联物在40℃左右，由于交联物很少，两个峰没有分开，但混合峰温仍高于对照。

姚芳莲等[14]研究认为明胶的交联产物交联度越大，膜的抗张强度越大，而断裂伸长率则下降。本研究发现，断裂强度的增加和断裂伸长率的下降却主要来源于明胶辐照过程中的降解反应。具体原因有待进一步的研究来解释。

4 结论

1）在有限水和无限氧气存在下，明胶的辐射分解反应是主要的，次要反应是交联。

2）辐照后明胶的黏度、凝胶强度、胶凝温度、断裂伸长率、分子质量、大分子蛋白组分含量与剂量呈负相关，而断裂强度、小分子多肽混合物含量和相对分子质量分布宽度与剂量呈正相关。

3）在辐射剂量超过17.2kGy的情况下，不溶物含量递增，熔化温度较对照的高。

[1]WANG Feng，GUO Enyan，SONG Enmin，et al.Structure and properties of bone-like-nanohydroxyapatite／gelatin／polyvinyl alcohol composites[J].Advances in Bioscience and Biotechnology，2010（1）：185-189.

[2]KUO Weiti，HUANG Hongyi，CHOU Minju，et al.Surface modification of gelatin nanoparticles with polyethylenimine as gene vector[J].Journal of Nanomaterials，2011（28）：1-5.

[3]KALE R N，BAJAJ A N.Ultraviolet spectrophotometric method for determination of gelatin crosslinking in the presence of amino groups[J].Journal of Young Pharmacists，2010，2（1）：90-94.

[4]SANDRA V V，ELS V，VEERLE B，et al.Gelatin functionalization of biomaterial surfaces：Strategies for immobilization and visualization[J].Polymers，2011，3：114-130.

[5]HAYDAR U Z，MUBARAK A K，RUHUL A K.Studies on the thermo-mechanical properties of gelatin based films using 2-hydroxyethyl methacrylate by gamma radiation[J].Open Journal of Composite Materials，2012（2）：15-21.

[6]KANG C J，LEE N Y，KWON J H，et al.Pectin-and gelatin-based film：Effect of gamma irradiation on the mechanical properties and biodegradation[J].Radiation Physics and Chemistry，2005，72（6）：745-750.

[7]韩军，朱天虹，袁信华，等.斑点叉尾鮰鱼头明胶

性质的研究[J].大连水产学院学报，2008，23（1）：42-46.

HAN Jun，ZHU Tianhong，YUAN Xinhua，et al.Physico-chemical characteristics of gelatin from channel catfish ictalurus punctatus heads[J].Journal of Dalian Fisheries University，2008，23（1）：42-46（in Chinese）.

[8]刘小玲，许时婴.鸡骨明胶的胶凝特性[J].食品与生物技术学报，2006，25（3）：122-126.

LIU Xiaoling，XU Shiying.Study on viscosityand gelling properties of chicken bone gelatin[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2006，25（3）：122-126（in Chinese）.

[9]刘海英，何磊，过世东.用差示扫描量热法分析明胶品质[J].食品与生物技术学报，2011，30（5）：675-678.

LIU Haiying，HE Lei，GUO Shidong.A new assay method on quality of gelatin with small sample size using DSC[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2011，30（5）：675-678（in Chinese）.

[10]李国英，张忠楷，雷苏，等.胶原、明胶和水解胶原蛋白的性能差异[J].四川大学学报：工程科学版，2005，37（4）：54-58.

LI Guoying，ZHANG Zhongkai，LEI Su，et al.Differences in properties of collagen，gelatin and collagen hydrolysate[J].Journal of Sichuan University：Engineering Science Edition，2005，37（4）：54-58（in Chinese）.

[11]刘建平，马旭，朱家璧.评价软胶囊中明胶交联反应的相关指标间的相关性及影响因素[J].药学学报，2005，40（3）：279-284.

LIU Jianping，MA Xu，ZHU Jiabi.Evaluation of correlation between gelatin crosslinking indicators and influence factors[J].Acta Pharmaceutica Sinica，2005，40（3）：279-284（in Chinese）.

[12]史京京，王颖，王智慧，等.明胶组分含量与交联剂反应的研究[J].明胶科学与技术，2001，21（1）：23-30.

SHI Jingjing，WANG Ying，WANG Zhihui，et al.Study on gelatin protein component and crosslinker[J].The Science and Technology of Gelatin，2001，21（1）：23-30（in Chinese）.

[13]李承华.辐射技术基础[M].北京：原子能出版社，1988：30.

[14]姚芳莲，李学强，于潇，等.京尼平对壳聚糖及明胶的交联反应[J].天津大学学报，2007，40（12）：1 485-1 489.

YAO Fanglian，LI Xueqiang，YU Xiao，et al.Crosslinking reaction of chitosan and gelatin with genipin[J].Journal of Tianjin University，2007，40（12）：1 485-1 489（in Chinese）.